吗啉环寡聚核苷酸(Morpholino)
过去在使用反义 (antisense) 抑制实验来探讨基因功能时，常因为反义核酸的不稳定、专一性差或效率低等问题，而造成实验的限制。美国 Gene Tools 公司独家推出的 Morpholino Oligo，将可解决这些困扰研究人员以久的缺陷，让您的实验更加简便而精确。
Morpholino oligo 是将 6 碳环之 Morpholine 接上硷基后，以非离子性的 phosphorodiamidate 连接而成 (如下图所示)。相较于过去在反义抑制实验中常用的 Phosphorothioate 及 PNA，Morpholino 能有更好之效率及专一性；较简便的使用方式而且较为便宜。
| Morpholino Oligos 特点 | |
| 稳定性高 (具核酸水解酵素 (nuclease) 抵抗性) | 可稳定存留于细胞内较长的时间可避免产生出具毒性的裂解物质。 |
| 效率高 | 即使作用浓度仅有 nanoMolar，也能有优越的抑制效果。 |
| 不须 RNase H | 可避免 RNase H 对与目标 RNA 相似的非目标 RNA 产生 裂解作用。 |
| 序列专一性高 | 其专一性为 Phosphorothioate 的 100 倍，即使在高浓度状况 下使用也不会降低其专一性。 |
| 对目标 RNA 结合能力好 | 可侵入目标 RNA 的二级结构，达到稳定结合的目的。 |
| 在细胞质及细胞核内皆有活性 | 可增加 Morpholino oligo 作用的机会。 |
| 在无细胞系统及细胞内皆适用 | Morpholino oligo 在有、无细胞之系统下，皆有良好之反义活性。 |
| 不受血清影响 | 不会与血清中之白蛋白 (albumin) 结合而降低其活性。 |
| 溶解度好 | 溶解度可高达100 mg/mL，且在保存过程中不易有沉淀发生。 |
| Oligo 长度最长 |
最长可提供至 25 mer 的 Morpholino oligo (为目前市售最长的)。即使 长度增加至 25 mer，仍能保有高专一性。 |
| 快速简单的递送方式 | 针对贴附型细胞可透过简单的刮细胞方式 (Scrape Delivery) 将 Morpholino oligo 运送入细胞中作用，避免使用 Liposome 所造成的细胞毒性，递送效率高(可高达 85~90%)。 |
| 经济实惠 | 价格较一般反义核酸便宜。 |
| siRNAs vs. Morpholinos | ||
| siRNA | versus | Morpholino |
| YES | More than 500 publications | YES |
| NO | Allows you to modify splicing | YES |
| NO | Effective & specific in embryos | YES |
| NO | Free of off-target effects | YES |
| NO | Free of interferon effects | YES |
| NO | Typical first-try targeting success | YES |
| NO | Functions in both cytosol & nucleus | YES |
| NO | Complete stability & long-term efficacy | YES |
| NO | Well understood mechanism | YES |
如何挑选 Morpholino Antisense Oligos 的作用区域
针对 post-spliced mRNA 上，由 5'-cap 到转译起始点 3' 端 25 个 bases 左右的这一段区域为最佳设计区段。
Morpholino oligo 的 self-complementarity 部分不可超过 4 个 bases。
Morpholino oligo 的 G 含量最好不要超过 36% (因为会降低 oligo 的溶解度)。
Morpholino oligo 的长度越长越好 (最长 25 个 mer)，然而 Morpholino oligo 的价格并非以长度来计算，因此同浓度情况下，25 mer 的 Morpholino oligo 不会比 18 mer 的 Morpholino oligo 来得昂贵。
Morpholino Antisense Oligo 的运送
在细胞实验方面可藉由电穿孔 (electrophoration) 或使用 Gene Tools 公司所开发的专利 "Endo-Porter" 试剂将 Morpholino oligo 送入细胞中作用；贴附型细胞还可简单利用刮细胞的方式将 Morpholino oligo 送入细胞中，欢迎洽询索取详细实验流程。
| Endo-Porter is a weak-base amphiphilic peptide that was designed to deliver Morpholino oligos, peptides or proteins into the cytosol of cultured cells by an endocytosis-mediated process. The mechanism of delivery entails rapid adsorption of Endo-Porter to cell surfaces, but this adsorption to the cell surface does not damage the plasma membrane. The membrane-bound Endo-Porter is rapidly endocytosed, along with Morpholinos in the medium. Natural acidification of the endosome protonates Endo-Porter that, in its ionic form, permeabilizes the endosome and releases the endosome contents into the cyotosol. |
在动物实验方面 Gene Tools 公司最新研发的 "Vivo-Morpholinos" 是在一般 Morpholino oligo 序列 3' 端连结了由八个 Arginine 胺基酸结构中的带正电基团 "Guanidium Group" 所组成的支链，此支链可协助 Morpholino oligo 以内吞作用 (endocytosis) 进入动物细胞中。目前已有多个小鼠及狗的成功案例显示，藉由简单的静脉或腹腔注射方式即可让 Vivo-Morpholinos 于动物体内发挥有效作用，且数据显示 Vivo-Morpholinos 毒性极低非常适合动物实验使用。欢迎洽询索取详细产品使用方式。
| (A) Morpholino oligo is a non-charged antisense oligonucelotide agent in which the ribose sugar is replaced by a six-membered morpholino ring and the phosphodiester bond is replaced by a phosphoroamidate linkage. (B) Vivo-Morpholinos are Morpholino oligos coupled with eight guanidinium head groups on dendrimer scaffolds that enable Morpholino applications in adult animals. |
Photo Morpholinos - 以光调节基因抑制时机与区域
"Photo Morpholinos" 是 Gene Tools 公司最新开发的基因抑制工具，相较于一般 morpholino，Photo-Morpholinos 是在 25mer morpholino oligo 序列中间镶嵌了一个光裂解的结构，此结构经由 365nm 光源照射即会断裂，使得 morpholino oligo 断裂成两个片段，失去与标的序列结合作用的能力。藉由善用 Antisense- 与 Sense- Photo-Morpholino 的实验设计，与控制光源照射时间与位置，研究者可轻松调控基因抑制的发生时机与区域，其应用包含：避免基因抑制而造成胚胎死亡、针对特定区域或特定时间点 进行基因抑制等。
| Photo Morpholinos 实验设计与应用：(A). Antisense Photo-Morpholinos strategy — 设 计为 Antisense 的 Photo-Morpholinos 原本可以抑制目标基因，当使用 365nm 光源照射后，即会使得 Photo-Morpholinos 裂解并失去抑制作用，造成基因再次被表现。可应用于在特定时间解除基因抑制作用，重新开启基因表现。 (B). Sense Photo-Morpholinos strategy — 设 计为 Sense 的 Photo-Morpholinos 其序列与目标基因相同，当与一般 MO antisense oligo 一同送入细胞内后，Photo-Morpholinos 会先结合上 MO antisense oligo，使得目标基因暂时不被抑制。当于特定时间点给予 365nm 光源照射后，MO antisense oligo 即被释放，发挥基因抑制作用。可应用于在特定时间点抑制基因表现。 From: http://blossombio.com/services/CustomMorpholinoAntisenseOligoSynthesis.html |