非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞提取与分离
一、实验动物选择与预处理
动物筛选标准
性成熟雌性爪蟾（体重≥90 g，泄殖孔松弛且无感染迹象）。
近6个月内未经历取卵手术，确保卵巢恢复周期（参考：NRC《实验动物护理与使用指南》）。
健康评估：排除体表溃疡、异常浮游或摄食抑制个体，检疫隔离≥7天。
麻醉方案
将爪蟾置于含碎冰的0.1xMMR缓冲液（4℃）中，维持30-45分钟。
麻醉终点判定：翻正反射消失，四肢肌肉松弛（避免麻醉过深导致呼吸抑制）。
科学依据：低温麻醉可降低代谢率，减少手术应激（参考：Sive et al., 2000）。
二、手术操作规范
手术器械灭菌
剪刀、镊子、缝合针线经高压灭菌（121℃, 20 min）或75%乙醇浸泡30分钟。
切口定位与操作
用钝头镊子轻拉宫瓣（Oviductal lobe），剪取所需卵母细胞团块（单次取卵量≤卵巢总量的1/3）。
术中保护：避免过度牵拉导致输卵管撕裂。
解剖标志：下腹部正中线（避开腹主动脉分支）。
切口尺寸：纵向切开皮肤及肌层0.5-1 cm（精确控制深度，避免损伤内脏）。
术后缝合与护理
将爪蟾置于浅水容器（水深≤2 cm），头部暴露于水面，室温（20-22℃）下自然复苏。
术后24小时内禁食，监测伤口愈合情况（红肿或渗出需局部涂抹红霉素软膏）。
肌层连续缝合（5-0可吸收缝线），皮肤间断缝合（6-0尼龙线）。
三、卵母细胞采集与预处理
卵母细胞保存液
OR2溶液配方（pH 7.8±0.1）：
成分 浓度（mmol/L） 功能 NaCl 41.0 维持渗透压平衡 KCl 1.0 稳定膜电位 MgCl₂ 0.5 防止卵母细胞粘连 HEPES 2.5 缓冲pH波动 储存条件：卵母细胞团块置于OR2溶液中，4℃保存≤2小时。
卵母细胞分离
用显微剪将卵母细胞团剪成含5-10个卵的小块。
转移至50 mL离心管，以OR2溶液洗涤5次（100×g离心1分钟），至上清液澄清。
质量控制：剔除破裂或褪色卵母细胞（健康卵母细胞呈均一棕黑色）。
四、卵母细胞酶解与培养
胶原酶消化
胶原酶Ⅰ型（Sigma C0130）溶于OR2溶液，终浓度0.5-2.0 mg/mL（依据卵母细胞成熟度调整）。
消化条件：
参数 设定值 温度 室温（22-25℃） 振荡频率 80 rpm（水平摇床） 时间 30-45分钟（镜下监测卵泡膜脱落） 终止消化：加入含10% FBS的OR2溶液终止反应，洗涤3次。
卵母细胞培养
分离后的卵母细胞转移至含OR2溶液的培养皿（直径60 mm），覆盖矿物油防止蒸发。
培养条件：17℃恒温培养箱（湿度70%，无CO₂），培养时间≤24小时。
成熟度判定：选择V-VI期卵母细胞（动物极色素均匀，直径≥1.2 mm）。
五、重复取卵管理
恢复周期：
术后恢复期≥6个月，期间提供高蛋白饲料（粗蛋白≥45%），促进卵巢再生。
取卵次数限制：
单只雌蟾终生取卵≤6次，避免卵巢纤维化（通过超声监测卵巢结构）。
六、质量控制与记录
关键参数记录
项目 标准范围 检测频率 卵母细胞存活率 ≥90%（台盼蓝染色） 每批次 胶原酶活性 200-400 U/mg 每新批次 OR2溶液渗透压 180-200 mOsm/kg 每周 异常处理
卵母细胞破裂：降低胶原酶浓度或缩短消化时间。
术后感染：立即隔离个体，皮下注射恩诺沙星（5 mg/kg）。
七、生物安全与伦理声明
动物福利
符合《实验动物管理条例》（2020修订版），手术全程遵循无菌原则。
废弃物处理
手术器械高温灭菌，生物组织经10%福尔马林固定后焚烧。
参考文献
Sive HL, et al. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. CSHL Press, 2000.
National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. 2011.
Smith JC, et al. Isolation and Culture of Xenopus laevis Oocytes. J Vis Exp, 2018.
