爪蟾蝌蚪全脑电转染方法（Whole brain electroporation)
一、技术原理与适用范围
原理
通过高压电场瞬时改变细胞膜通透性，实现大分子（如质粒DNA）高效跨膜转运。定向电穿孔可靶向特定脑区（如单侧或双侧），适用于神经发育与功能研究（Haas et al., 2002）。适用对象
非洲爪蟾蝌蚪（Nieuwkoop-Faber分期42-48期）。
目标分子：质粒DNA（0.2-2.0 μg/μl）、吗啉基(Morpholino)、siRNA、RNAi等。
二、设备与耗材清单
| 类别 | 设备/耗材 | 规格/型号 | 关键参数 |
|---|---|---|---|
| 核心设备 | 显微操作系统 | Sutter MP-285 | 三维移动精度±0.1 μm |
| 电脉冲发生器 | Grass SD9 Stimulator | 输出范围0-100 V, 脉冲宽度0.1-100 ms | |
| 电容模块 | 定制（并联电容组） | 总电容200 μF | |
| 注射系统 | 微压力注射仪 | Picospritzer III (Parker Hannifin) | 最小注射体积10 nL |
| 玻璃微电极 | Borosilicate, 1.0 mm OD | 尖端直径10-20 μm | |
| 电极系统 | 铂金电极 | 定制（1×2 mm铂片） | 电极间距1.5-2.0 mm |
| 辅助工具 | 解剖显微镜 | Leica M80 | 8-40×连续变倍，LED冷光源 |
| 渗透压计 | Advanced 3320 | 测量范围0-3000 mOsm/kg |
三、实验前准备
DNA溶液配制
质粒要求：超纯质粒（A260/A280=1.8-2.0，内毒素<0.1 EU/μg）。
工作液配方：
成分 浓度 功能 质粒DNA 0.2-2.0 μg/μL 目标基因载体 Fast Green 0.01% (w/v) 注射定位指示剂 稀释液 2 mM CaCl₂ 增强DNA吸附效率 分装保存：-20℃避光储存，避免反复冻融（≤3次）。
动物预处理
麻醉：0.02% MS-222浸泡5-7分钟至翻正反射消失。
体位固定：将蝌蚪置于湿润滤纸（Kimwipe），暴露头部脑区。
四、电穿孔操作流程
脑室DNA注射
注射参数: 压力：10-15 psi
单次注射量：75-125 nl（覆盖全脑室需100 nl，局部靶向需50 nl）。
微电极制备：P-87拉制仪参数：Heat=580, Pull=100, Vel=60，获得尖端直径15 μm电极。
质量控制：通过Fast Green染色确认脑室充盈（图1A）。
电极定位与参数设置
电极放置：铂电极平行置于目标脑区两侧（间距1.5 mm），轻触表皮（图1A）。
电脉冲参数：
参数 标准范围 调整策略 电压 30-50 V 低电压（30 V）靶向局部，高电压（50 V）全脑转染 脉冲数 2-7次 每增加1脉冲，转染效率提升15% 脉冲波形 指数衰减（τ=70 ms） 确保膜电位充分去极化 电穿孔执行
单侧转染：负极靠近靶区（DNA向正极迁移）。
双侧转染：交替切换脉冲极性（需同步触发装置）。
成功标志：电极接触点产生微米级气泡（图1A），蝌蚪眼动反射存在。
失败标志：大泡沸腾或全身抽搐（立即终止并降低电压）。
术后处理
复苏：转移至含0.1xMMR的复苏槽（22℃），10-15分钟恢复自主游动。
存活率评估：24小时存活率应≥90%（不合格批次需检查电容漏电或麻醉过深）。
五、质量控制与优化
转染效率评估
荧光检测：转染后48小时，4% PFA固定，共聚焦显微镜定量GFP+细胞密度（图1C,E）。
共转染率：双质粒（EGFP:DsRed=1:1）共转染率70±10%（流式细胞术验证）。
组织完整性检查
组织学染色：H&E切片评估脑室结构，排除出血或水肿（发生率<5%）。
细胞活性：Propidium碘染色（1 μg/ml，15分钟）确认细胞死亡率≤2%。
六、故障排除与应急预案
| 问题现象 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 无荧光表达 | DNA降解或电极接触不良 | 更换新鲜质粒，乙醇清洁铂电极 |
| 脑室出血 | 注射压力过高或电极穿刺损伤 | 降低注射压力至8 psi，钝化电极尖端 |
| 术后高死亡率（>30%） | 电压过载或渗透压失衡 | 校准电脉冲输出，检测溶液渗透压 |
七、安全与伦理声明
生物安全：质粒操作需在BSL-1级实验室进行，废弃DNA经1% SDS/0.5 M NaOH灭活。
动物伦理：符合ARRIVE 2.0指南，实验方案经IACUC审批（协议编号：XLA-2023-09）。
图1 电穿孔关键步骤：（A）脑室注射电极放置；（B）单侧靶向转染；（C）单侧视顶盖有效转染GFP；（D）双侧靶向转染；（E）全脑GFP表达。
参考文献
Haas K, et al. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 2002.
Sive HL, et al. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods Cell Biol. 2010.