爪蟾卵母细胞的分离与培养
一、目的
非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞分离、消化及体外培养的标准流程，适用于电生理研究、外源基因表达及蛋白质功能分析。
二、材料与试剂
1. 主要试剂
| 试剂名称 | 规格/品牌 | 储存条件 |
|---|---|---|
| 胶原酶Ⅰ型 | Sigma C0130 | -20℃（分装避光） |
| MS222麻醉剂 | Sigma E10521 | 4℃避光 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco 15140-122 | -20℃ |
| 丙酮酸钠 | Sigma P2256 | 室温干燥 |
2. 溶液配制
1.8 Ca²⁺ ND96培养液（pH 7.4）
| 成分 | 浓度（mM） | 用量（1 L） |
|---|---|---|
| NaCl | 96 | 5.61 g |
| KCl | 2 | 0.15 g |
| MgCl₂ | 1 | 0.10 g |
| CaCl₂ | 1.8 | 0.26 g |
| 丙酮酸钠 | 2.5 | 0.28 g |
| HEPES | 5 | 1.19 g |
| 青霉素 | 100 IU/mL | 1 mL（10⁵ IU/mL） |
| 链霉素 | 100 μg/mL | 1 mL（100 mg/mL） |
配制步骤：
依次溶解于800 mL Milli-Q水，磁力搅拌至澄清（CaCl₂最后加入）。
调节pH至7.4±0.05（用1 M NaOH）。
定容至1 L，0.22 μm滤膜无菌过滤，4℃保存（有效期7天）。
0 Ca²⁺ ND96溶液：
在上述配方中去除CaCl₂，其余成分相同。
三、操作流程
1. 卵母细胞提取
麻醉与手术：
麻醉选择：
冰麻法：将爪蟾埋入碎冰（4℃）30分钟，检测后肢反射消失。
MS222法：0.1% MS222溶液浸泡10分钟。
手术操作：
固定爪蟾于冰预冷托盘（腹面朝上），塑料膜隔离皮肤与冰面。
左下腹切开1 cm切口（皮肤→肌层），暴露卵巢瓣。
取卵后分层缝合（5-0可吸收缝线闭合肌层，6-0尼龙线缝合皮肤）。
术后护理：
复苏环境：浅水（22℃含50 IU/mL青霉素），48小时观察伤口愈合。
2. 卵母细胞分离与消化
机械分离：
将卵巢组织置于0 Ca²⁺ ND96中，用钟表镊撕成10-20细胞/团。
洗涤5次（0 Ca²⁺ ND96，100×g离心1分钟）至上清澄清。
胶原酶消化：
消化液配制：1 mg/mL胶原酶Ⅰ型（0 Ca²⁺ ND96溶解）。
消化条件：
20 mL消化液，22℃摇床（70 rpm）。
吹打间隔：前30分钟每10分钟吹打，后续每5分钟监测。
终止标准：80%卵母细胞游离（滤泡膜脱落）。
终止与清洗：
加入10倍体积0 Ca²⁺ ND96终止反应。
洗涤3次（100×g离心），转移至1.8 Ca²⁺ ND96培养液。
3. 卵母细胞筛选
发育分期标准：
| 分期 | 形态特征 | 直径（μm） | 适用实验 |
|---|---|---|---|
| I-II | 透明/半透明，无色素分布 | 50-450 | 早期发育研究 |
| III-IV | 局部色素沉着，动物极分化 | 450-1000 | 基因显微注射 |
| V-VI | 动物极深棕，植物极乳白，赤道亮环清晰 | 1000-1300 | 电生理记录/蛋白表达 |
筛选标准：
仅选择V-VI期卵母细胞（膜完整、表面光滑无损伤）。
剔除破裂、褪色或残留滤泡膜的细胞。
四、培养与质控
培养条件：
温度：18-20℃（恒温培养箱）。
培养基：1.8 Ca²⁺ ND96（含双抗），每日更换。
存活率检测：
台盼蓝染色：0.4%染色5分钟，死亡率≤5%。
膜电位监测：静息电位≥-40 mV（玻璃微电极记录）。
五、关键注意事项
温度控制：
手术环境：4-6℃（冰麻法）。
消化与培养：22℃±1℃。
钙离子管理：
消化全程使用0 Ca²⁺ ND96，防止蛋白酶激活损伤细胞。
水质要求：
饲养水：除氯处理（曝气≥48小时），pH 7.0-7.5。
六、安全与伦理
个人防护：
手术操作佩戴无菌手套及护目镜。
动物福利：
单只雌蟾取卵间隔≥6个月，总取卵次数≤5次。
实验方案需通过IACUC审查（参考《实验动物福利指南》）。
废弃物处理：
生物组织经10%福尔马林固定后高压灭菌（121℃, 30分钟）。
参考文献
Smith JC, et al. Xenopus laevis Oocyte Isolation and Culture. J Vis Exp. 2018.
NIH. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. 2011.