非洲爪蟾个体早期发育

非洲爪蟾（south African clawed toad, Xenopus laevis）是目前最常用的两种模式低等脊椎动物。以非洲爪蟾为代表物种的两栖类动物因易于实验室养殖、可诱导产卵、胚胎体外发育、产卵量大(一次几千枚)、胚胎体积大(直径约1.2 mm)而易于显微操作等优点，仍然被认为是发育生物学研究的几大模式生物之一，为脊椎动物发育生物学研究，特别是早期胚胎发育研究做出了非常重要的贡献。  

非洲爪蟾个体早期发育主要经过卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、轴胚形成等阶段。爪蟾胚胎发育起始于精卵结合，受精卵经过快速细胞增殖形成囊胚，囊胚晚期不同区域的细胞开始分化；随后进入原肠期，胚胎细胞经原肠运动形成不同的胚层和体轴，细胞命运沿背腹轴线和头尾轴线进一步分化；原肠期结束后，神经板开始形成神经管，胚胎进入分节期(神经胚)，沿头尾轴线上的细胞进一步区域化以形成相应的器官原基。  

一、 卵裂 

在卵裂过程中不仅DNA合成快,而且已知在有些动物中，卵裂无G1期。爪蟾除无G1期外，G2期也很短，以致整个分裂周期短。因此两次分裂之间的时间比成体细胞的短得多。 非洲爪蟾的卵裂模式为完全卵裂中的两侧对称式卵裂，卵裂面将受精卵完全分开，卵裂球大小相差不多，一般少黄卵（均黄卵）都为全裂。中量端黄卵也进行全裂，但动、植物极卵裂球大小相差较多。 

非洲爪蟾第一个卵裂沟正试图分裂植物极具卵黄的卵质时，第二个卵裂沟已于动物极开始形成。第二次卵裂与第一次成直角而且都是经线型。第三次是纬线裂，但由于植物极富含卵黄，因此卵裂沟偏向动物极一端。 这样在动物极形成4个小的卵型球，而于植物极则形成了4个大的卵型球。这种不均等的分裂使胚胎形成两个不同的区域，一个是靠近动物极的迅速分型的小卵裂球区城，另一个是靠近植物极分裂较馒的大卵裂球区域。随着不断分裂，在动物极区域堆积了无数小的细胞，而在植物极区域则由数量相对较少、体积大、富含卵黄的大卵裂球形成。  

二、 囊胚 

囊胚随着卵裂的进行逐渐形成，在早期分裂球较大，晚期则分裂球体积减小，数量增加，到16-细胞期时分裂速度减慢，对于爪蟾来说，由16-64细胞构建的胚胎常被称为桑葚胚。在128细胞阶段，形成明显的囊胚腔，因而被称之为囊胚。 在近动物极形成小分裂球，而近植物极由于卵黄的阻碍而形成大分裂球，分裂球的周围是大量的卵黄细胞。  

三、 原肠胚 

非洲爪蟾的中胚层前体只存在于深层细胞中，位于赤道区域表面细胞下面，而外胚层和内胚层则来源于表面的表层细胞中。 

非洲爪蟾预定内胚层细胞内陷，形成狭缝状胚孔（slit-like blastopore），内陷引发原肠形成。但是，非洲爪蟾原肠作用并不是在最靠近植物极处开始内陷，而是在动物半球和植物半球汇合的赤道附近，即所谓的边缘区（marginal zone）开始内陷。内陷细胞称为瓶状细胞（bottle cell），它们沿最初的原肠排列 。瓶状细胞的收缩拉动边缘区细胞向植物极运动，同时将植物极的内胚层细胞推向胚胎的内部。边缘区细胞的运动导致外胚层细胞向植物极外包，预定前端中胚层细胞沿囊胚腔内表面延伸。 

原肠作用的下一个时期包括边缘区细胞的内卷以及动物半球细胞的外包和向胚孔处集中。迁移中的缘区细胞到达胚孔的背唇时，转向内部沿着外层细胞的内表面运动，因此构成背唇的细胞在不断更新。最初构成背唇的细胞为内陷形成原肠前缘的瓶状细胞，它们随后发育为前肠咽部的细胞。 

随着瓶状细胞进入胚胎内部，背唇被后来内卷进入胚胎发育为头部中胚层前体的细胞代替。接下来，由胚孔背唇内卷进入胚胎的细胞为脊索中胚层细胞，它们将形成脊索。脊索是一个临时性中胚层脊柱（backbone），对诱导神经系统的分化起重要的作用。内卷进入胚胎的脊索中胚层细胞在胚胎背部集中延伸变窄变长，形成胚胎的轴性中胚层。 非洲爪蟾原肠作用期间Brachyury基因的表达，示预定中胚层细胞的集中和延伸。晚期原肠胚的轴旁中胚层表达paraxial protocadherin，而脊索表达axial protocadherin ，两种钙粘着蛋白对集中和延伸起重要的作用。 随着新细胞进入胚胎内部，囊胚腔被挤压到与背唇相对的一侧。同时随着胚孔处瓶状细胞形成和内卷，胚唇向侧面和腹面延伸，形成新月状结构。新月状胚孔进一步延伸，先形成侧唇，在形成腹唇。通过侧唇和腹唇，位于外胚层细胞中的中胚层和内胚层细胞继续内卷，使胚孔形成一环状，包绕在含有大量卵黄、体积较大的内胚层细胞周围，这些内胚层细胞暴露在植物极外面，称为卵黄栓（yolk plug）。 

最终，卵黄栓也被包入内部。至此，所有内胚层细胞都已进入胚胎的内部，外胚层细胞包被在胚胎的表面，而中胚层细胞则位于内胚层和中胚层之间。 

非洲爪蟾的原肠作用是数个事件和谐的组合，结果是把内中外三个胚层细胞置于适当的位置，为它们分化为不同的器官做准备。  

非洲爪蟾原肠作用总结： 

1. 边缘区瓶状细胞在准确的时间和位置内陷。 2. 边缘区细胞通过胚唇进行内卷形成原肠。 3. 内卷的中胚层细胞沿胚孔顶壁内表面迁移。 4. 预定脊索中胚层在胚胎背部集中延伸 

5. 预定外胚层细胞通过细胞分裂和数层细胞合并为单层细胞而向植物极下包。  

四、 神经胚 

神经胚早期，卵黄栓退缩，胚孔由于侧唇愈合而封闭，背腹唇相互接近，这时胚孔变为原条结构，此时迅速的细胞增殖使两边的侧唇厚度增加(图1-9)，到神经胚晚期，原肠逐渐变长，其功能结构更加复杂：前肠形成口腔后部和肝盲囊等结构，隆起的中肠将形成小肠，还有后肠及外突的肛门；并且El部和心脏原基等原始结构也开始出现。神经板的两侧向上突起形成弧形的神经褶，它们向脊中线移动，形成神经沟，继而两边神经褶高举抱合成神经管结构，在神经管的下方形成棒状的脊索结构，并一直从头部延伸到尾部(图1．10)。在神经胚阶段，细胞类型更加丰富，除了原肠胚阶段出现的间质细胞外，在脊索下方出现了大小不同，结构不同，染色效果不同的各种细胞。  

五、 轴胚 

1. Nieuwkoop中心的分子生物学研究 

非洲爪蟾的内胚层细胞通过诱导预定中胚层细胞表达Xenopus Brachyury （Xbra）基因，进而诱导中胚层的形成。 

最靠近背侧的植物半球细胞，由于表达一些特殊的细胞因子而形成Nieuwkoop中心。β-CATENIN是Nieuwkoop中心的一个主要细胞因子。 

β-catenin是一种母体效应基因，其编码的蛋白质β-CATENIN既能锚定细胞膜上的钙粘着蛋白，又是一个核内转录因子。 

β-CATENIN在受精时卵质的旋转移动过程中在预定胚胎背部累积，在整个早期卵裂阶段仍然主要在胚胎背部累积。到卵裂晚期只有Nieuwkoop中心的细胞具有β-CATENIN 。β-CATENIN 对于形成背部结构是必要的。β-CATENIN属于Wnt信号传导途径的一个分子，糖原合成激酶-3 （GSK-3）对β-CATENIN有负调控作用，进而对背侧细胞的分化起抑制作用。在腹侧细胞中GSK-3介导的磷酸化作用引起β-CATENIN的降解，而在背侧细胞中由于存在GSK-3的抑制因子Disheveled （DSH）蛋白，所以背侧的β-CATENIN不会被降解。DSH蛋白开始存在于爪蟾未受精卵植物半球的皮层部，受精时沿微管迁移到胚胎的背侧起作用。β-CATENIN与一种普遍存在的转录因子TCF3结合形成的复合物能够激活对胚轴形成具有重要作用的其他基因，如siamois （sms）基因。SMS能激活goosecoid基因的表达。goosecoid基因是Nieuwkoop中心分泌蛋白因子作用的主要靶基因之一。gcd mRNA表达的区域与组织者的范围有关。GCD能够激活脑形成关键基因Xotx2，使其在前端中胚层和预定脑外胚层表达。 

gcd基因的激活也同时受到定位于植物半球和Nieuwkoop中心的TGF－β家族蛋白产物的协同作用。这里所涉及的TGF －β 蛋白因子是Vg1、VegT和Nodal相关蛋白。 

β-CATENIN与VG1、VEGT信号相互作用的结果形成Nodal-相关蛋白从背侧到腹侧的浓度梯度。Nodal-相关蛋白的浓度梯度使中胚层细胞分化。含有大量Nodal相关蛋白的分化为组织者，较少的分化为侧板中胚层，不含Nodal相关蛋白的分化成腹侧中胚层。 总之，为维持正常的发育，在胚胎背部细胞中必须含有β-CATENIN，并使sms基因表达，SMS与TGF-β基因家族的蛋白质协同作用使gcd基因激活，在SMS和GCD等共同作用下才能形成组织者。组织者的形成涉及多种基因的激活，存在于Nieuwkoop中心的分泌蛋白激活位于其上方中胚层细胞中一系列转录因子，后者再激活编码组织者分泌产物的一些基因。  

2. 第一类组织者分泌性蛋白因子和BMP抑制因子 

BMP4是最重要的上皮分化和腹侧化诱导因子。对于神经发生而言，它是抑制因子或抗神经化因子，其功能与组织者正好相反。 

组织者分泌的NGN、CHD、Nodal相关蛋白－3和FST对BMP4均有抑制作用。因此组织者的功能是分泌抑制诱导作用的可溶性蛋白因子，而不是直接诱导中枢神经系统的发  

3. 第二类组织者分泌性蛋白因子和WNT抑制因子 

咽鳃区内胚层和头部中胚层形成的内-中胚层组织构成胚孔背唇的前缘。这些细胞不仅能诱导最前端的头部结构，而且还能够阻滞WNT信号传导途径。WNT家族的成员之一WNT8与BMP4相似，能够抑制神经诱导。 

组织者分泌的CERBERUS（CBR）和内中胚层分泌的FRZB和DICKKOPF（DCK）蛋白因子可以组织WNT信号传导途径。  

4.  后端化因子 

随着前端神经系统的区域性特化神经管，后端开始进行分化。后端的分化由胚胎后端产生后端化因子进行调控。 

成纤维细胞生长因子eFGF、WNT3a和视黄酸（Retinoic acid，RA）都是后端化因子。RA主要作用于后脑的图式形成；eFGF对于脊髓的分区最为重要；而WNT3a可以抑制前端控制基因的表达，还可以协调RA和eFGF的作用。  

5. 中侧轴特化因子 

脊椎动物中侧轴形成的关键事件都是原肠胚左侧侧板中胚层表达的nodal-相关基因调控。 爪蟾的nodal-相关基因-1（Xnr-1）的表达区域仅限于原肠胚左侧，Xnr-1激活pitx-2在胚胎左侧专一性表达。VG1蛋白可以增加胚胎左右对称的特化，异位表达VG1可导致胚胎左右逆转