1. 目的
通过人绒毛膜促性腺激素（hCG）背侧皮下注射，诱导非洲爪蟾自然抱对交配，获取受精卵用于胚胎发育研究或蝌蚪繁育。
2. 材料
2.1 试剂
- 人绒毛膜促性腺激素（hCG），粉末状，临用前溶于无菌生理盐水（0.9% NaCl）
- 1× MBS-H 或 Steinberg's 培养液（用于收集卵块与孵化）
2.2 设备
- 1 mL 无菌注射器（26–27 G 针头）
- 45–75 L 水族箱，含底部隔离网（防止亲蛙摄食卵）
- 控温循环水系统（20±1 ℃）
- 弱红光照明设备（<5 lux）
3. hCG 注射参数
| 参数 | 雄性（♂） | 雌性（♀） |
|---|
| 注射剂量 | 200 IU | 500 IU |
| 注射浓度 | 500 IU/mL | 500 IU/mL |
| 注射体积 | 0.4 mL | 1.0 mL |
| 注射部位 | 背侧皮下淋巴囊 | 背侧皮下淋巴囊或臀部肌肉 |
| 注射时机 | 交配前 12–14 h | 交配前 8–10 h |
4. 操作步骤
4.1 注射前准备
- 筛选性成熟、体况良好的亲蛙：雄性体重 ≥60 g，婚垫明显，泄殖腔扩大；雌性体重 ≥90 g，腹部丰满饱满，泄殖腔唇红色突出；有体表损伤、异常漂浮或拒食个体须排除；新到动物须经 ≥7 天检疫隔离后方可使用。
- hCG 粉末溶于无菌生理盐水，配制成 500 IU/mL 工作液，4 ℃ 保存，24 h 内用完。
- 注射前使爪蟾平静（置于浅水中静置 5 min），避免应激导致排卵异常。
4.2 注射操作
- 徒手持握法（参见注射规范操作），保持爪蟾腹面向上，轻固定四肢防止挣扎。
- 针头以约 45° 角刺入背侧皮下淋巴囊（腰背部皮肤），缓慢注入药液；拔针后轻按注射点防止药液外渗。
- 注射完毕后雄雌分置单独水箱，等待性腺激活，不得强行配对。
4.3 交配设置
- 配对时间约 17:00–18:00（爪蟾夜行性，夜间排卵率高）。
- 按雌雄 1:1 放入交配水箱；水深 15–20 cm，温度 20±1 ℃，pH 6.8–7.2（CO₂ 缓冲维持）；底部铺孔径 2 mm 尼龙网（距缸底约 5 cm），防止亲蛙摄食卵；可放置 PVC 管等环境丰富物以减少应激行为。
- 切换为弱红光照明（<5 lux），减少光照干扰。
- 确认抱对（雄性紧抱雌性腰部）后记录时间；有效抱对持续 ≥1 h。
4.4 卵块收集与孵化
- 交配后 12–16 h 检查产卵情况，用宽口吸管或钝头镊子轻轻转移卵块至孵化培养皿（1× MBS-H）。
- 孵化温度 22–24 ℃，溶氧 ≥7 mg/L，避免阳光直射；每日清除白化死卵。
- 孵化率 ≥85% 为合格批次；48–72 h 出现自由游动蝌蚪（NF45 期前后）；未受精或粘连卵块可用 0.1% 胰蛋白酶溶液轻处理后去除。
5. 亲本移除与术后护理
- 产卵完成后 24 h 内将亲蛙转移至恢复水箱（含 0.01% 亚甲蓝），单独静养 48 h，观察伤口愈合与体况恢复。
- 注射 hCG 后 72 h 内禁止再次注射，避免卵巢过度激活损伤动物健康。
- 同一只雌蛙相邻两次注射间隔 ≥3 个月；未产卵时可于 24 h 后补注同等剂量 1 次，补注次数不超过 1 次。
6. 生物安全与伦理
- 所有操作遵循动物福利伦理规范（GB/T 35892-2018），须取得本单位动物实验伦理批准。
- 废弃 hCG 药液及注射器按医疗废物处理；废弃生物材料须高压灭菌（121 ℃，30 min）后按规处置。
- 操作 hCG 时须佩戴丁腈手套，避免皮肤直接接触激素类药物；病弱个体禁止参与繁殖实验。
雌性爪蟾每年参与繁殖实验不超过 4 次，每次间隔 ≥3 个月，以保证卵质量与动物健康。NF37/38 期前的胚胎依赖卵黄供能，禁止投喂外源饲料。
参考文献References
- Wu M & Gerhart J (1991) Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol 36:3–18.
- Tinsley RC & Kobel HR (eds) (1996) The Biology of Xenopus. Oxford University Press, Oxford.
- Sive HL, Grainger RM, Harland RM (2000) Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.